Saccharomyces cerevisiae vs. degradácia a produkcia organických kyselín

Katarína Furdíková, Jozef Ševcech, Katarína Ďurčanská, Fedor Malík, FCHPT STU Bratislava

Abstrakt
Kyselina jablčná a kyselina mliečna sú najdiskutovanejšími kyselinami v teórii enológii i v reálnej výrobe vína. Vďaka svojej zvieravo kyslej chuti a mikrobiálnej nestabilite je kyselina jablčná jednou z látok, ktorých by malo víno (najmä však červené) obsahovať čo najmenej. Opačným prípadom je kyselina mliečna, ktorej kyslosť je jemnejšia a vďaka svojim konzervačným účinkom pomáha víno prirodzene stabilizovať. Výsledná koncentrácia týchto dvoch kyselín vo víne je dôsledkom pôsobenia mliečnych baktérií, ale tiež rôznych druhov kvasiniek.

Abstract
Malic acid and lactic acid are mostly discussed acids in enological theory and also in real winemaking technology. Degradation of rough and microbiologically unstable malic acid and production of tender and protecting lactic acid are essential for production of wines with smooth acidity and high stability. Resulting concentration of these acids is a consequence of action of lactic acid bacteria but also of some yeast species. One species which is able to manage these acids is also Saccharomyces cerevisiae.

Úvod

Hroznový mušt v závislosti od odrody viniča a vyzretosti plodov môže obsahovať 1 – 8 g/l kyseliny jablčnej a 0 – 1 g/l kyseliny mliečnej. Vo vínach sa bežne nachádza 0 – 4 g/l kyseliny jablčnej a 1 – 6 g/l kyseliny mliečnej. K zníženiu koncentrácie kyseliny jablčnej a nárastu kyseliny mliečnej vo víne dochádza viacerými spôsobmi. Najzaužívanejším spôsobom je jablčno-mliečna fermentácia vedená mliečnymi baktériami. Homofermentatívne a heterofermentatívne mliečne baktérie fermentujú kyselinu jablčnú, pričom produkujú kyselinu mliečnu a oxid uhličitý. Jablčno-mliečna fermentácia je nepostrádateľná pri výrobe červených vín, žiaduca je však aj pri niektorých typoch bielych vín. Či už ide o vyzrievanie sur lie, alebo o proces riadenej, či spontánnej jablčno-mliečnej fermentácie, platí, že víno nesmie obsahovať nadmerné dávky oxidu siričitého (viac ako 100 mg/l celkového SO2) a fermentačná teplota nemá klesnúť pod 15 °C. Vysoká koncentrácia SO2 a alkoholu, nízka fermentačná teplota a nedostatočná dusíková výživa sú faktory, ktoré výrazne inhibujú mliečne baktérie a jablčno-mliečnu fermentáciu spomaľujú, alebo úplne zastavia.

Tabuľka 1 Opis prípravy muštov Frankovky modrej pre experiment vplyvu kmeňa S. cerevisiae na profi l organických kyselín vo víne

Tabuľka 2 Degradácia kyseliny jablčnej a produkcia kyseliny mliečnej počas fermentácie sterilného hroznového muštu pomocou rôznych kmeňov Saccharomyces cerevisiae (T=20 °C, 15 dní)

Alternatívnou cestou degradácie kyseliny jablčnej je využitie rôznych druhov vínnych kvasiniek. Kvasinkový druh Schizosaccharomyces pombe (obr.1) je známy tým, že túto kyselinu dokáže kompletne degradovať na etanol a oxid uhličitý (Rankine a Fornachon 1964). V technológii výroby vína sa však Sch. pombe používa len zriedka, a to najmä kvôli svojmu vplyvu na ostatné senzorické vlastnosti vína (Redzepovic a kol., 2003). Sch. pombe však nie je jediným druhom kvasiniek, ktoré sú schopné degradovať kyselinu jablčnú v médiu. Najrozšírenejší a najznámejší druh vínnych kvasiniek – Saccharomyces cerevisiae (obr. 2) má tiež túto schopnosť. Na rozdiel od Sch. pombe, ktorý na transport kyseliny jablčnej využíva aktívy systém, však do bunky Saccharomyces cerevisiae vstupuje jablčnan jednoduchou difúziou. Aj keď je biochemický mechanizmus pre degradáciu kyseliny jablčnej u S. cerevisiae a Sch. pombe rovnaký, substrátová špecifickosť jablčného enzýmu S. cerevisiae je asi 15-krát nižšia (Radler, 1993, Ansanay a kol., 1996). Nízka substrátová afinita spolu so sťaženým transportom kyseliny jablčnej do bunky sú zodpovedné za nedostatočný metabolizmus kyseliny jablčnej pri S. cerevisiae.

Kyselina mliečna sa vo víne vyskytuje v dvoch izomérnych formách – D, L. Kvasinky produkujú D formu kyseliny mliečnej, zatiaľ čo baktérie formu L. Meraním L-formy kyseliny mliečnej tak možno sledovať aktivitu baktérií vo víne (Ribéreau-Gayon a kol., 2006). Fakt, že kvasinky pri alkoholovej fermentácii dokážu produkovať kyselinu mliečnu, je známy desiatky rokov. Literatúra však uvádza, že kvôli nedostatočnej aktivite enzýmu laktátdehydrogenáza pri fermentačných podmienkach, dokážu prírodné kmene Saccharomyces cerevisiae produkovať počas alkoholovej fermentácie iba stopy kyseliny mliečnej (Dequin a Barre 1994).

Snahou enologického výskumu je získať kmene schopné simultánnej alkoholovej fermentácie a degradácie kyseliny jablčnej a tiež kmene schopné alkoholovo-mliečnej fermentácie. V pokuse produkovať kyselinu mliečnu z glukózy pomocou Saccharomyces cerevisiae, boli do laboratórnych kvasničných kmeňov vložené laktátdehydrogenázu kódujúce gény baktérií Lactobacillus casei a Lactobacillus bovine (Skory, 2003). Praktickým výsledkom výskumu paralelnej alkoholovej fermentácie a degradácie kyseliny jablčnej je geneticky manipulovaný kmeň S. cerevisiae ML01. Zatiaľ čo v USA a v Kanade je možné tento kmeň priemyselne využívať, Európska únia použitie akýchkoľvek geneticky manipulovaných organizmov nepovoľuje. Z tohto dôvodu je stále aktuálna cesta izolácie a selekcie prírodných kmeňov kvasiniek. Primárne stanovištia sú obrovským rezervoárom kvasiniek a možno medzi nimi nájsť kmene s rozmanitými technologickými vlastnosťami.

Problematikou autochtónnych kvasiniek druhu Saccharomyces cerevisiae sa na Oddelení biochemickej technológie FCHPT STU zaoberáme dlhodobo a v ostatných štúdiách sme sa zamerali aj na charakterizáciu degradácie a produkcie rôznych organických kyselín.

Materiál a metódy

Ako substrát na sledovanie degradácie kyseliny jablčnej a produkcie kyseliny mliečnej pomocou S. cerevisiae sme použili plody Frankovky modrej. Bobule hrozna (bez strapiny) sme rôznym spôsobom homogenizovali a macerovali tak, ako uvádzame v tabuľke 1. Pripravené mušty sme centrifugovali (3500 min-1, 10 min). Rovnaké objemy muštov (100 ml) v jednotlivých sériách sme sterilizovali parou a naočkovali rôznymi autochtónnymi čistými kultúrami Saccharomyces cerevisiae a fermentovali pod kvasným uzáverom pri teplote 20 °C. Pred fermentáciou a po jej ukončení sme vo vzorkách izotachoforeticky stanovili profil organických kyselín.

Stanovenie kyselín izotachoforézou

Organické kyseliny sme stanovili izotachoforeticky. Separácia sa uskutočnila v elektrolyte pôsobením jednosmerného elektrického prúdu na elektroforetickom analyzátore EA 102 s vyhodnocovacím zariadením. Vodiacim elektrolytom bol roztok 10 mM HCl a β-alanínu (0,1 % m-HEC pH=3,0). Terminálnym roztokom bola 5 mM kyselina octová.

Výsledky a diskusia

Výsledky merania degradácie kyseliny jablčnej a produkcie kyseliny mliečnej v hroznovom mušte pomocou rôznych autochtónnych kmeňov Saccharomyces cerevisiae uvádzame v tabuľke 2.

Aby sa zabránilo pôsobeniu baktérií, všetky tri série muštov sme pred fermentáciou sterilizovali. Etanol pridaný k rmutu (séria III) slúžil na lepšiu extrakciu látok s pokožky bobúľ a sterilizáciou sa odparil, takže v tomto prípade nemožno skúmať vplyv etanolu na degradáciu a produkciu kyselín. Maceráciou s prídavkom etanolu sa však do muštu extrahovalo približne o 1 g/l kyseliny jablčnej viac, ako pri jednoduchom lisovaní bobúľ (séria I – ružový mušt). Kyselina mliečna sa v zdravom hrozne nachádza v minimálnej koncentrácii, a tak samovoľná extrakcia ani extrakcia s prídavkom etanolu koncentráciu kyseliny mliečnej v macerovanom mušte neovplyvnila.

Väčšina testovaných autochtónnych kmeňov S. cerevisiae dokázala znížiť koncentráciu kyseliny jablčnej, a to v priemere o 27 %. Najnižšiu degradačnú schopnosť mal kmeň S. cerevisiae ZW-D (4 – 11 %), naopak, maximálnu schopnosť degradácie kyseliny jablčnej sme zaznamenali pri  kmeni S. cerevisiae FM-R-FIX2, ktorý v sérii III dokázal degradovať 43 % kyseliny jablčnej.

Kyselinu mliečnu produkovali všetky sledované autochtónne kultúry a priemerná produkcia tejto kyseliny bola 0,52 g/l. Maximálnu produkciu (1,03 g/l) sme pozorovali pri kmeni S. cerevisiae ZW-D, ktorý degradoval najmenej kyseliny jablčnej a naopak, minimálnu produkciu kyseliny mliečnej (0,25 g/l) sme zaznamenali pri S. cerevisiae FM-R-FIX2, ktorý kyselinu jablčnú degradoval spomedzi všetkých kmeňov najlepšie.

Záver

Saccharomyces cerevisiae nie je zodpovedný len za alkoholovú fermentáciu, aj  keď je to vo vinárstve jeho primárna funkcia. S. cerevisiae ovplyvňuje víno ako celok a svojim metabolizmom vplýva na všetky zložky senzorického profilu vína. Jedným z jeho aktivít je aj „manažment“ organických kyselín. Schopnosť S. cerevisiae vo významnej miere degradovať kyselinu jablčnú a produkovať kyselinu mliečnu, je z pohľadu enológie a vinárskej praxe veľmi žiadaná. Aplikácia čistých kultúr S. cerevisiae so schopnosťou degradácie kyseliny jablčnej, produkcie kyseliny mliečnej a súčasnej bezproblémovej alkoholovej fermentácie, môže byť riešením pre mnohé (nielen slovenské) vína.

Literatúra

Ansanay, V., Dequin, S., Camarasa, C., Schaeffer, V., Grivet, J.P., Blondin, B., Salmon, J.M., Barre, P., 1996.: Malolactic fermentation by engineered Saccharomyces cerevisiae as compared with engineered Schizosaccharomyces pombe. Yeast 12, 215–225.
Dequin, S. and Barre, P., 1994.: Mixed lactic acid-alcoholic fermentation by Saccharomyces cerevisiae expressing the Lactobacillus casei L(+)- LDH. Bio/Technology 12, 173–177.
Radler, F., 1993.: Yeast: Metabolism of organic acids. In Wine Microbiology and Biotechnology. Ed. G.H. Fleet (Harwood Academic Publishers: Chur, Switzerland), 165–182.
Rankine, B.C. and Fornachon, J.C.M., 1964.: Schizosaccharomyces malidevorans sp.n., a yeast decomposing L malic acid. Antonie Van Leeuwenhoek 30, 73–75.
Redzepovic, S. Orlic, S, Majdak, A., Kozina, B., Volschenk, H., Viljoen-Bloom, M., 2003.: Differential malic acid degradation by selected strains of Saccharomyces during alcoholic fermentation. International Journal of Food Microbiology 83 (1), 49-61.
Ribéreau-Gayon, P., Dubourdieu, D., Donèche, B., Lonfaud, A., 2006.: Handbook of Enology, John Wiley. LTD Chichester.
Skory, C.D., 2003.: Lactic acid production by Saccharomyces cerevisiae expressing a Rhizopus oryzae lactate dehydrogenase gene. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 30, 22–27.

Tagy:5/2010