Abstract

Higher alcohols are important group of volatile compounds of each wine. These volatiles are generally considered as yeast metabolism products but they are found also in grapes before alcoholic fermentation. The aim of this paper was to describe profi le of higher alcohols during fermentation of 7 varietal wines and identify alcohols typical for the primary aroma of wine (alcohols originated strictly from grapes) and those produced by the microorganisms. Regardless of yeast strain used for the fermentation and variety of wine, dominant higher alcohols in grape juice and must were 2-hexene-1-ol, 2-ethyl hexanol, 1-octen-3-ol and 1-hexanol. Concentration of these alcohols signifi cantly decreased as a result of stripping by carbon dioxide and esterifi cation. 2-Methyl butanol, 2,3-butanediol and 1-propanol were identifi ed only in wines and do not occur in grape must/juice before fermentation. These alcohols are typical metabolites of microorganisms. 3-Methyl butanol (isoamyl alcohol) and 2-phenyl ethanol were identifi ed both in wines and grapes. Despite of their major signifi cance in wine, they cannot be considered strictly as alcohols of secondary aroma of wine. 

ÚVOD

Aróma vína je dôležitým parametrom kvality vína. Je tvorená zlúčeninami s nízkym bodom varu, ktoré sú prchavé a majú rôznu chemickú povahu a vlastnosti. Tieto zlúčeniny sa často súhrnne označujú ako prchavé organické zlúčeniny (VOC). Vo vínach bolo identifikovaných viac než 800 VOC s rôznymi hodnotami koncentrácií varírujúcimi od mg/l až po ng/l [1, 2]. Aj malé rozdiely v koncentráciách a zložení týchto zlúčenín značne ovplyvňujú preferencie zákazníka, či zaradenie sa vín medzi svetovo uznávané alebo len priemerné vína. Každé víno má jedinečné zastúpenie VOC, ktoré sú akoby jeho odtlačkom prsta. Niektoré môžu byť charakteristické pre danú odrodu alebo ročník, iné sú variabilné v závislosti od podmienok a technológie [3, 4].

V procese výroby dochádza vždy k zmenám v zastúpení VOC a aromatický profil výsledného vína je iný, než bol na začiatku v mušte. Vznik vína je dynamický proces, pri ktorom látky vznikajú, zanikajú a vzájomne sa transformujú. Mechanizmy, ktoré ovplyvňujú profil VOC vo víne zahŕňajú metabolizmus viniča, metabolizmus mikroorganizmov, rôzne chemické reakcie nevyžadujúce prítomnosť enzýmov a tiež stupeň extrakcie látok z nádob určených na vyzrievanie vína.

Na pochopenie zložitosti aromatického profilu vína sa prchavé látky vo víne zadeľujú do niekoľkých skupín. Prchavé látky produkované metabolizmom viniča tvoria primárnu arómu vína, VOC produkované metabolizmom kvasiniek a baktérií vytvárajú sekundárnu arómu vína. Terciárna aróma vína je tvorená látkami vznikajúcimi esterifikačnými, kondenzačnými či oxidačnými reakciami, a to bez účasti živých mikroorganizmov.

Primárna aróma vína sa tvorí v bobuliach hrozna a  je typická pre danú odrodu viniča. Najviac aromatických látok sa nachádza v šupke neporušených bobúľ a tesne pod jej povrchom. Okrem genetickej predispozície odrody a stupňa zrelosti bobule má na formovanie primárnych aromatických látok vplyv tiež terroir  (t.z. eografická poloha vinice, klimatické podmienky v nej, starostlivosť o vinicu) a stres, ktorému je vinič vystavený (choroby, škodcovia, hospodárenie rastliny s vodou) [5]. Z chemického hľadiska tvoria primárnu arómu vína najmä terpenoidy, metoxypyrazíny a ušľachtilé prchavé sírne zlúčeniny. Súčasťou primárnej arómy sú však aj iné látky, ako napríklad vyššie alkoholy, estery, aldehydy, ketóny a rôzne ďalšie prchavé látky.

Sekundárna aróma (fermentačný buket) vzniká v procese spracovania muštu a počas fermentácie. Na prchavé zlúčeniny je kvalitatívne aj kvantitatívne najbohatšia. Časť sekundárnej arómy sa formuje už v predfermentačnom procese, pri mletí hrozna a úpravách muštu. Macerácia má vplyv na štiepenie mastných kyselín a vznik rôznych degradačných produktov, najmä C6 aldehydov a alkoholov. Ďalšie zlúčeniny vznikajú počas alkoholovej fermentácie metabolizmom kvasiniek a počas jablčno-mliečnej fermentácie metabolizmom mliečnych baktérií. Aromatické látky sekundárnej arómy môžu byť do prostredia uvoľňované priamo ako vedľajšie metabolity hlavného metabolizmu sacharidov, alebo syntetizované de novo či transformované z prekurzorov nachádzajúcich sa v mušte. Sú tvorené početnými skupinami esterov, vyšších alkoholov, aldehydov, prchavých kyselín, prchavých sírnych a fenolových zlúčenín [6]. Charakter sekundárnej arómy je determinovaný najmä kmeňom kvasiniek, zložením muštu a teplotou fermentácie. Každý kmeň kvasiniek má svoj vlastný enzymatický aparát a individuálne nároky na výživu. Pri fermentácii muštov s rôznym pôvodom a tým istým kmeňom kvasiniek vzniknú preto vína s odlišným zložením a arómou [7, 8].

Vyššie alkoholy sú vedľajšie metabolity rastlín a kvasiniek a sú podstatnou zložkou sekundárnej arómy vín a destilátov. Sú charakteristické ovocnou, herbálnou, prípadne kvetinovou arómou a ich celková koncentrácia vo víne je približne 100 – 500 mg/l. Zatiaľ čo koncentrácie vyšších alkoholov nižšie ako 300 mg/l dodávajú vínu komplexnosť a plnosť, koncentrácie presahujúce 400 mg/l majú na víno negatívny účinok a prepožičiavajú mu silnú zvieravú vôňu a chuť [9].

Vyššie alkoholy vznikajú anabolickými dráhami priamo z ketokyselín, alebo katabolickými dráhami z aminokyselín (Ehrlichova dráha). Aminokyseliny sa transaminujú na ketokyseliny a tie sa následne dekarboxylujú, čím vzniká príslušný vyšší alkohol [3]. n-Amylalkohol, izoamylalkohol, izobutanol, 2-fenyletanol, tyrozol, tryptofol a metionol vznikajú degradáciou aminokyselín izoleucín, leucín, valín, fenylalanín, tyrozín, tryptofán a metionín, ktoré sú prirodzenou súčasťou hroznového muštu, alebo sa doňho dostávajú prostredníctvom aplikovanej dusíkatej výživy (kvasničné extrakty, prípravky na báze bunkových stien). Počas skorej rastovej fázy je aminokyselina kompletne degradovaná a príslušný alkohol je produkovaný až neskôr, v stacionárnej fáze. Spoločným prekurzorom všetkých vyšších alkoholov sú α-ketokyseliny, ktoré sú dekarboxylázou transformované na  príslušný aldehyd a  ten je redukovaný alkoholdehydrogenázou na alkohol [10].

Majoritným vyšším alkoholom vo víne (viac ako 50 %) je izoamylalkohol, ktorý v optimálnych koncentráciách dodáva vínu arómu sladkého ovocia, v nadmernej koncentrácii však jeho aróma pripomína odlakovač na nechty. Ostatné vyššie alkoholy (butanol, izobutanol, 2-butanol, 2,3-butándiol, hexanol) taktiež prepožičiavajú vínu sladké a parfumové tóny, vyskytujú sa však v nižších, niekedy až podprahových koncentráciách (tab. 1).

Rôzne druhy a kmene kvasiniek ovplyvňujú profil vyšších alkoholov vo víne rôznym spôsobom, pričom nesacharomycétne kvasinky prispievajú k vyšším hladinám vyšších alkoholov. Výsledná koncentrácia vyšších alkoholov závisí tiež od fermentačnej teploty, aerácie a miešania, koncentrácie utilizovateľného dusíka a sacharidov [7].

Vyššie alkoholy prítomné vo víne sú všeobecne považované za produkty metabolizmu kvasiniek, tieto prchavé zlúčeniny však boli mnohokrát potvrdené aj v samotnom hroznovom mušte. Cieľom práce bolo zistiť, ako sa alkoholovou fermentáciou mení profi l vyšších alkoholov vo víne a špecifi kovať, ktoré vyššie alkoholy sú typickými predstaviteľmi primárnej arómy vína (pochádzajú striktne z hrozna) a ktoré sú vytvárané metabolizmom kvasiniek.

MATERIÁL A METÓDY

Relatívna koncentrácia vyšších alkoholov bola sledovaná vo vzorkách muštov, resp. rmutov rôznych odrôd viniča a tiež vín, ktoré vznikli spracovaním uvedených vstupných surovín (tab. 2). V experimente boli použité mušty a vína odrôd Tramín červený, Muškát žltý, Rizling rýnsky, Rulandské modré, Cabernet Sauvignon a  Rulandské sivé (2 vzorky). Vína boli vyrobené štandardným výrobným postupom v reálnych výrobných podmienkach.

Analýza prchavého profilu vzoriek bola vykonaná metódou dvojrozmernej plynovej chromatografie, ktorej predchádzalo vysolenie prchavých zložiek do plynnej fázy a extrakcia na tuhé vlákno (HS-SPME-GCxGC-MS/TOF). Konkrétny postup analýzy a vyhodnotenia získaných dát je publikovaný v práci Makyšová a kol. (2015) [11]. Ako vnútorný štandard bol pri analýze použitý benzofenón (20 μl metanolového roztoku s koncentráciou 1,60.10-2 mg/ ml), pomocou ktorého bola vyjadrená relatívna koncentrácia jednotlivých analytov vo vzorke (relatívna koncentrácia je vyjadrená ako podiel plochy chromatografického píku identifikovanej látky a plochy píku vnútorného štandardu). Získané údaje boli štatisticky spracované metódou analýzy hlavných komponentov, a to s využitím softvéru Statgrafi cs plus for Windows 3.0.

VÝSLEDKY A DISKUSIA

V tabuľke 3 sú uvedené výsledky analýzy profilu vyšších alkoholov, potvrdených vo vzorkách hroznových muštov a z nich vyrobených vín. Výsledky sú pre všetky analyzované vzorky uvedené ako relatívne koncentrácie a pre všetky mušty a vína je vypočítaná priemerná hodnota relatívnej koncentrácie (AVG).

V analyzovaných vzorkách bolo potvrdených celkovo 32 vyšších alkoholov. Mušty obsahovali priemerne 21 vyšších alkoholov, najmenej bolo identifikovaných v mušte odrody Cabernet Sauvignon (10) a najviac v mušte odrody Rizling rýnsky (22). Vo vínach sa nachádzalo priemerne 26 vyšších alkoholov, početne najviac bolo identifikovaných vo vzorke vína Tramín červený (31) a najmenej vo vzorkách vín Cabernet Sauvignon a Rulandské sivé 1 (16). Z hľadiska početnosti obsahovali vína viac vyšších alkoholov, ako mušty pred fermentáciou.

Sumárna relatívna koncentrácia vyšších alkoholov pred fermentáciou a po fermentácií nevykazuje pri skúmaných vzorkách rovnaký trend a je úzko spätá s metabolizmom kvasiniek použitých na fermentáciu. Vo vzorke Tramín červený (TČ) a Rulandské sivé 2015 (RS2) došlo počas fermentácie k poklesu celkového množstva vyšších alkoholov, v ostatných vzorkách bol pozorovaný nárast ich celkovej koncentrácie. K poklesu koncentrácie vyšších alkoholov dochádza niekoľkými spôsobmi. Prvým – fyzikálnym spôsobom – je strhávanie týchto vysoko prchavých látok pomocou oxidu uhličitého, vznikajúceho ako hlavný produkt alkoholovej fermentácie. Ďalším významným elementom je esterifikácia – reakcia alkoholu s kyselinou, ktorej výsledkom je menej či viac prchavý ester. Enzymatická esterifikácia prebieha za účasti metabolického aparátu kvasiniek, či baktérií, neenzymatická len ako chemická reakcia dvoch molekúl zdieľajúcich dlhodobo rovnaký priestor.

Profil vyšších alkoholov vo vzorkách muštov a vín bol významne odlišný. Štatistickým porovnaním vzoriek muštov a vín pomocou analýzy hlavných komponentov (PCA) bolo zistené, že pre mušty je typická prítomnosť špecifických C6 a C8 alkoholov. Najvýznamnejšie z hľadiska odlíšiteľnosti muštu a vína sú 2-hexen-1-ol, 2-etylhexanol, 1-okten-3-ol a 1-hexanol. Z hľadiska kvantity je pre mušt dominantný 1- hexanol, ktorý bol zaznamenaný v najvyššej relatívnej koncentrácii vo vzorke muštu Tramín červený (214,0) a tiež 2-hexen-1-ol s priemernou relatívnou koncentráciou 25,4 a najvyššou zaznamenanou hodnotou v mušte odrody Cabernet Sauvignon (52,3). 2-Etylhexanol, 2-hexen-1-ol, 2-okten-1-ol, 3-hexen-1-ol, 3-oktanol, 1-hexanol a 1-okten-3-ol sú typickými predstaviteľmi primárnej arómy vína. Tieto alkoholy sa v hroznovom mušte nachádzajú v najvyššej koncentrácii a fermentáciou sa ich koncentrácia iba znižuje.

Medzi vyššie alkoholy, ktorých prítomnosť je typická pre vína, patria 2-metylbutanol (n-amyl alkohol), 2,3-butándiol a 1-propanol. Sú to typické produkty metabolizmu kvasiniek Saccharomyces cerevisiae, ktoré neboli potvrdené v žiadnej zo skúmaných vzoriek hroznového muštu, no vo významnej koncentrácii sa nachádzali vo všetkých vzorkách vín. Výsledná koncentrácia 2-metylbutanolu, 2,3-butándiolu a 1-propanolu vo víne závisí od fermentačných podmienok (koncentrácia a profi l živín, fermentačná teplota) a od enzymatickej, resp. genetickej výbavy použitého kmeňa kvasiniek [7, 12].

Najširšiu skupinu vyšších alkoholov vo vzorkách tvorili alkoholy, ktoré boli potvrdené aj v mušte aj vo výslednom víne, ich relatívna koncentrácia však po fermentácii stúpla. Koncentrácia 1-heptanolu, 4-metylpentanolu, 1-oktanolu, benzylalkoholu, 1-pentanolu, 3-metylpentanolu, 1-nonanolu, 2-nonanolu a 1-butanolu vo víne oproti muštu zaznamenala len mierny nárast. 

Najvýznamnejší nárast relatívnej koncentrácie bol zaznamenaný v súvislosti s izoamylalkoholom (nárast priemernej hodnoty z 0,1 na 165,2), 2-fenyletanolom (priemerne 1,4 v  mušte vs. 103,6 vo vínach) a izobutanolom (nárast o 15,5). 3-Metylbutanol (izoamylalkohol) a  2-fenyletanol sa v porovnaní s ostatnými vyššími alkoholmi vo vzorkách vín nachádzali v najvyššej relatívnej koncentrácii. Izoamylalkohol vo víne podporuje tóny zrelej hrušky a banánu, no v nadmernej koncentrácii jeho aróma pripomína riedidlo. 2-Fenyletanol je charakteristický sladkou parfémovou vôňou zmesi čajovej ruže a ovocia.

Prítomnosť vyšších alkoholov uvedených v tabuľke 3 označením „var“ je možné zhodnotiť ako variabilnú. Ich výskyt nie je typický pre každý hroznový mušt či víno, no môže participovať na vytváraní prchavého profilu typického pre určitú odrodu, terroir, či kmeň kvasiniek použitý pri fermentácii.

ZÁVER

Vyššie alkoholy sú dôležitou skupinou prchavých látok každého vína. Ako vedľajšie produkty metabolizmu kvasiniek sú produkované počas alkoholovej fermentácie, čím významne formujú sekundárnu arómu vína. Mnohé vyššie alkoholy sú však v mušte prítomné ešte pred fermentáciou a sú syntetizované samotným viničom. Bez ohľadu na použitý kmeň kvasiniek a odrodu viniča bolo experimentálne potvrdené, že dominantnými vyššími alkoholmi hroznového muštu (alkoholy primárnej arómy) sú 2-hexen-1-ol, 2-etylhexanol, 1-okten-3-ol a  1-hexanol. Koncentrácia týchto alkoholov v priebehu alkoholového kvasenia dramaticky klesá v dôsledku ich strhávania oxidom uhličitým či transformáciou na príslušné estery. Naopak, pre víno sú typické alkoholy 2-metylbutanol, 2,3-butándiol a 1-propanol, ktoré sa v mušte prakticky nevyskytujú a sú výhradne produktom metabolizmu mikroorganizmov. Vyššie alkoholy 3-metylbutanol (izoamylalkohol) a 2-fenyletanol majú vďaka svojej vysokej koncentrácii majoritné postavenie vo víne. Napriek významnému nárastu koncentrácie týchto alkoholov počas etanolovej fermentácie ich však nemožno striktne zaradiť k alkoholom sekundárnej arómy vína, pretože boli potvrdené aj v samotnom mušte pred fermentáciou. Sú teda produktom metabolizmu viniča, ako aj mikroorganizmov zúčastňujúcich sa fermentácie.

Katarína Furdíková, Lucia Bajnociová, Katarína Makyšová, Fedor Malík, Ivan Špánik, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie, STU Bratislava

POĎAKOVANIE

Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe zmluvy č. APVV-15-0333. Ďakujeme tiež vinárstvam Natural Domin & Kušický, s.r.o. a Dubovský & Grančič, s.r.o. za spoluprácu na experimentoch.

LITERATÚRA
[1] Schreier, P.: Flavor composition of wines: a review. CRC Crit. Review Food Sci. Nutr. 12, 59–11, 1979
[2] Li, H.: Wine Tasting. Beijing, China. China Science Press, 29–106, 2006.
[3] Falque, E., Fernández, E., Dubourdieu, D.: Diff erentiation of white wines by their aromatic index, Talanta 54, 271–281, 2001
[4] Zea, L., Moyano, L., Moreno, J. A., Medina, M.: Aroma series as fi ngerprints for biological ageing in fi no sherry-type wines, Journal of the Science of Food and Agriculture, 87, 2319–2326, 2007
[5] Orduña, M.R.: Climate change associated eff ects on grape and wine quality and production. Food Res. Int. 43, 1844-1855, 2010
[6] Bartowsky, E.J., Pretorius, I.S.: Microbial formation and modifi cation of fl avor and off -fl avor compounds in wine. Biology of Microorganisms on Grapes, in Must and in Wine. Springer-Verlag, Berlin, 2009
[7] Furdíková, K., Ševcech, J., Ďurčanská, K., Hronská, H., Malík, F.: Infl uence of diff erent nutrition conditions on main volatiles of wine yeasts, Journal of Food and Nutri
tion Research. 53, (4), 304–312, 2014
[8] Romano, P., Fiore, C., Paraggio, M., Caru, M., Capece, A.: Function of yeast species and strains in wine fl avour. International Journal of Food Microbiology, 86, 2003, 169–180, 2003 [9] Patel, S., Shibamoto, T.: Eff ect of diff erent strains of Saccharomyces cerevisiae on production of volatiles in Napa Gamay wine and Petite Sirah wine. J Agric Food Chem. 50(20), 5649-53, 2002 [10] Hazelwood, L., Daran, J-M., A., Van Maris, J. A., Pronk, T.J., Dickinson, T.: The Ehrlich Pathway for Fusel Alcohol Production: a Century of Research on Saccharomyces cerevisiae Metabolism, Minireview, Appl. Env. Microbiol. 2259–2266, 74, (8), 2008 [11] Makyšová, K., Furdíková, K., Špánik, I.: Čisté kultúry Saccharomyces cerevisiae verzus zlúčeniny primárnej arómy vína – terpenoidy. Vinič a víno 1, príloha 5 – 7, 2016 [12] Swiegers, J.H., Bartowsky, E.J., Henschke, P.A., Pretorius, I.S.: Yeast and Bacterial Modulation of Wine Aroma and Flavour: Part 7. The Australian Journal of Grape and Wine Research 11, 139-173, 2005

 

Tags: