Produkcia majoritných látok sekundárnej arómy vína pomocou čistých kultúr kvasiniek Saccharomyces cerevisiae

Jednotlivé zlúčeniny vznikajú v rôznych štádiách výroby vína a ich koncentrácia sa v čase mení. Podľa toho, kedy prchavé zlúčeniny vznikajú, delíme arómu vín na primárnu, sekundárnu a terciárnu. Zložky primárnej arómy pochádzajú z hrozna, sekundárna aróma vzniká v procese spracovávania muštu a fermentácie a terciárna aróma vzniká počas zrenia a starnutia vína [3].

Vyššie alkoholy, prchavé kyseliny a  estery, sú z  hľadiska kvantity najvýznamnejšími zložkami sekundárnej arómy vína. Ich vývoj počas fermentácie a zrenia vína nie je lineárny. Všetky prchavé látky prítomné v médiu počas fermentácie podliehajú tzv. strippingu – strhávaniu oxidom uhličitým, ktorý je generovaný ako hlavný produkt alkoholovej fermentácie. Koncentrácia všetkých prchavých látok vo vznikajúcom víne tak počas fermentácie neustále klesá. Alkoholy a kyseliny môžu spolu reagovať za vzniku príslušných esterov, čím dochádza k zníženiu príslušných prekurzorov. Estery môžu podliehať kyslej hydrolýze a  môžu z  nich spätne vznikať alkoholy a organické kyseliny. V dôsledku týchto rôznych chemických dejov a  reakcií sa koncentrácia prchavých organických zlúčenín počas procesu fermentácie mení [4, 5].

Cieľom práce bolo sledovať fermentáciu hroznového muštu a definovaného fermentačného média rôznymi kmeňmi kvasiniek Saccharomyces cerevisiae z pohľadu majoritných prchavých organických zlúčenín a ich vývoja v čase.

MATERIÁL A METÓDY

Priebeh vývoja vybraných prchavých organických zlúčenín bol sledovaný počas fermentácie v štvrťprevádzkových podmienkach (hroznový mušt) a  laboratórnych podmienkach (definované YD médium) (obr. 1). Obidve fermentačné médiá boli zaočkované dvomi rôznymi kultúrami kvasiniek Saccharomyces cerevisiae (počiatočná koncentrácia biomasy 106 buniek/ ml). Použitými kmeňmi bola komerčná kultúra Oenoferm belle arome (Erbslőh Geisenheim) a autochtónny kmeň S. cerevisiae TC-NDK-DP2 zo zbierky kvasiniek Ústavu biotechnológie, FCHPT STU. Na analýzu v štvrťprevádzke bol použitý hroznový mušt odrody Tramín červený, ročník 2016. Hroznový mušt, čiastočné produkty jeho fermentácie a konečné víno pochádzali z vinárstva VÍNO NATURAL Domin & Kušický, s.r.o. Počiatočná cukornatosť muštu bola 22,5 °NM. Fermentácia prebiehala v nádobách s objemom 30 l a pri riadenej teplote fermentácie 17 °C. Na laboratórnu fermentáciu bolo použité YD médium s koncentráciou glukózy 225 g/l, kvasničného extraktu 8 g/l a pH 3,5 upraveným kyselinou vínnou. Fermentácia prebiehala v ná- dobe s objemom 4 l pri teplote 17 °C.

Počas fermentácie boli z kvasiacich médií (muštu aj YD pôdy) odoberané vzorky, ktoré boli analyzované z hľadiska základných enologických parametrov, ako aj z hľadiska profilu prchavých látok. Redukujúce sacharidy vo vzorkách boli stanovené Schoorlovou metódou, etanol pyknometricky na základe mernej hmotnosti destilátu získaného zo vzorky a koncentrácia utilizovateľného dusíka bola stanovená dvojkrokovou titráciou roztokom 0,05M KOH s prídavkom formaldehydu. Prchavý prof l vzoriek bol analyzovaný metódou komprehensívnej dvojrozmernej plynovej chromatografie [6]. Z  nameraných výsledkov boli zostrojené krivky produkcie vybraných prchavých látok v čase. Výsledky sú uvádzané prostredníctvom relatívnych plôch píkov sledovanej látky (Arel vypočítané ako pomer plochy píku danej prchavej látky a benzofenónu – vnútorného štandardu použitého pri analýze) a nepredstavujú konkrétne koncentrácie. Pomocou tejto metódy je však možné porovnávať vzorky medzi sebou.

VÝSLEDKY A DISKUSIA

Fermentácie v laboratórnych aj štvrťprevádzkových podmienkach prebiehali plynule po  dobu približne 14 dní. Počas fermentácie a  v  prípade hroznového muštu aj v postfermentačnej fáze boli priebežne odoberané vzorky, v ktorých boli stanovené hlavné analytické parametre a tiež prchavé organické zlúčeniny (obr. 2). V  jednotlivých vzorkách bolo identif kovaných približne 250 zlúčenín tvoriacich prchavý profil vína. Sedem majoritných prchavých organických zlúčenín (izoamylalkohol, 2-fenyletanol,2,3-butándiol, etyloktanoát, etyldodekanoát, kyselina oktánová a kyseliny dodekánová) bolo sledovaných z hľadiska ich vývoja v čase.

VYŠŠIE ALKOHOLY

Izoamylalkohol, 2-fenyletanol a 2,3-butándiol sú vyššie alkoholy, ktoré sú typickými produktmi metabolizmu kvasiniek [5]. Potvrdzujú to aj ich veľmi malé relatívne koncentrácie na začiatku a narastajúci trend počas fermentácie.

Majoritnou zlúčeninou tejto skupiny bol izoamylalkohol (3-metylbutanol), ktorý sa vyznačuje fermentačnou, dráždivou, banánu podobnou arómou. Produkcia izoamylalkoholu je v bunke kvasinky viazaná na metabolizmus sacharidov, ale je tiež súčasťou Ehrlichovej dráhy. Východiskovou zlúčeninou produkcie izoamylalkoholou je aminokyselina leucín, ktorá je transaminovaná na  α-ketokyselinu 4-metyl-2-oxopentanoát, ktorá sa ná- sledne dekarboxyluje na aldehyd 3-metylbutanal (izoamylaldehyd) a oxiduje na 3-metylbutanol (izoamylalkohol) [6]

V YD médiách začala intenzívna produkcia izoamylalkoholu v počiatku fermentácie a pokračovala do 2. – 3. dňa, kedy sa ustálila (obr. 3). V druhej polovici fermentácie (8. deň) sa jeho produkcia opäť naštartovala. Pri fermentácii hroznového muštu kmeňom TC-NDK-DP2 sa produkoval lineárne od  prvého dňa fermentácie. Pri kmeni Oenoferm belle arome sa produkoval od druhého dňa a v okolí 8. dňa dochádza k postupnej stagnácii produkcie.

Ďalším majoritným alkoholom produkovaným kvasinkami bol 2-fenyletanol. Podobne ako izoamylalkohol, aj tento vyšší alkohol vzniká v metabolizme Ehlrichovej dráhy, no jeho prekurzorom je aminokyselina fenylalanín [7]. 2-Fenyletanol je charakteristický sladkou vôňou ruže a vo vínach podporuje prirodzené kvetinové arómy [8]. Jeho produkcia má podobne narastajúci trend ako bol pozorovaný pri izoamylalkohole, len s menej prudkým nárastom (obr. 3). V YD médiách aj v mušte sa produkuje od prvého dňa fermentácie. 2-Fenyletanol bol identifikovaný v malom množstve už v mušte, je teda pravdepodobne syntetizovaný aj viničom, ale majoritný nárast jeho produkcie bol pozorovaný až počas fermentácie.

Dvojsýtny alkohol 2,3-butándiol v mušte pred fermentáciou identifikovaný nebol. Vo víne vzniká metabolizmom kvasiniek (redukciou acetoínu) a jeho koncentrácia závisí od podmienok a použitého kmeňa S. cerevisiae [9]. Intenzívnejší nárast koncentrácie 2,3-butándiolu nastáva až v okolí tretieho dňa fermentácie. Pri kmeni TC-NDK-DP2 bola zaznamenaná vyššia produkciu ako pri kmeni Oenoferm belle arome (obr. 2). 2,3-Butándiol má maslový, krémový odor a horko-sladkú chuť, ktoré ale vzhľadom na vysoký prah vnímania tejto látky (600 mg/l) neboli senzoricky zaznamenané [9].

PRCHAVÉ KYSELINY

Prchavé kyseliny počas fermentácie vykazovali nárast. To súvisí s  faktom, že výskyt prchavých organických kyselín vo víne je vo väčšine prípadov podmienený fermentáciou [8].

Medzi majoritné prchavé kyseliny vo víne patrí popri kyseline octovej najmä kyselina oktánová. Je súčasťou každého vína a v nadmerných koncentráciách vytvára mastné a voskové arómy [10]

Pri fermentácii YD média kmeňom TC-NDK-DP2 bol nástup produkcie kyseliny oktánovej pozorovaný od prvého dňa, pokračoval ustálením v 6. až 8.dni fermentácie a opätovným intenzívnejším nárastom do 10.dňa fermentácie (obr. 4). Pri fermentácii kmeňom Oenoferm belle arome bola produkcia dvojnásobne vyššia. Na druhej strane pri fermentácii hroznového muštu boli dosiahnuté rapídne vyššie relatívne koncentrácie kmeňom TC-NDK-DP2.

V  prípade kyseliny dodekánovej bol v  prvých 5 dňoch alkoholového kvasenia hroznového muštu pozorovaný  extrémny nárast tejto kyseliny (obr. 4). V  nasledujúcich 5 dňoch bol pozorovaný jej úbytok (spôsobený pravdepodobne esterif káciou) a následne opätovné zvýšenie produkcie. V priebehu postfermentačnej fázy prišlo k dramatickej strate kyseliny dodekánovej. V  YD médiu kvasenom kmeňom TC-NDK-DP2 nebol v  úvodných dňoch procesu pozorovaný tak rapídny nárast ako pri mušte. Relatívna plocha píku postupne narastala a v 5.dni nastala stacionárna fáza jeho produkcie. V  prípade kmeňa Oenoferm belle arome mala kyselina dodekánová v YD médiu podobný vývoj v porovnaní s fermentáciou v mušte.

V prvých dvoch dňoch došlo k rapídnej produkcii, následne sa kyselina dodekánová pravdepodobne esterif kovala s príslušnými alkoholmi (až do 11. dňa) a záver bol spojený s opätovným nárastom.

ESTERY

Estery sú najpočetnejšou skupinou prchavých organických zlúčenín a ich tvorba je podmienená enzymaticky alebo chemicky. Enzymatická cesta závisí od použitého kmeňa kvasiniek a jeho enzymatickej výbavy. Chemická cesta súvisí s udržiavaním rovnováhy medzi neenzymatickou esterif káciou a hydrolýzou a prebieha v procese starnutia vína [11].

Etyloktanoát, ktorý svojim odorom tropického ovocia, ananásu a jablka, dodáva vínam svieže ovocné tóny vo vzorkách fermentovaných médií dosahoval pomerne vysoké relatívne plochy píkov. Mal pomalší nástup produkcie, ktorá rapídne narástla pri fermentácii kmeňom TC-NDK-DP2 v piatom dni fermentácie (obr. 5), čo spôsobilo dvojnásobnú produkciu vo f nálnom stave oproti kmeňu Oenoferm belle arome. Rozdiel vo výslednej relatívnej koncentrácii bol zachovaný aj pri fermentácii muštu, ale v tomto prípade bol trend vývoja podobný pre obidva použité kmene. Intenzívnejší nárast produkcie etylaktanoátu nastal v postfermentačnej fáze.

Produkcia etyldodekanoátu v  mušte sa vyznačuje extrémnym vzrastom v  prvých piatich dňoch fermentácie a  následným intenzívnym poklesom. Po ukončení fermentácie došlo k jeho úplnému poklesu pri kmeni  Oenoferm belle arome. Vo víne vyrobenom kmeňom TC-NDK-DP2 zostal aj v dôsledku jeho dvakrát väčšej produkcie v úvodných dňoch. V YD médiu etyldodekanoát produkovaný kmeňom TC-NDK-DP2 menej a od 8.dňa fermentácie jeho relatívna koncentrácia postupne klesala. Produkcia kmeňom Oenoferm belle arome bola dvojfázová: začala v prvom dni fermentá- cie, v 6.-11. dni bola pozorovaná stacionárna fáza a po nej nastal rapídny nárast (obr. 5 )

ZÁVER

Vyššie alkoholy, estery a prchavé kyseliny sú vo veľkej miere zodpovedné za sekundárnu arómu. Vznikajú prevažne metabolizmom kvasiniek a aj s ohľadom na to je výber vhodného kmeňa kvasiniek veľmi dôležitým aspektom pri výrobe vína. Intenzita metabolickej aktivity je pri každom kmeni S. cerevisiae a podmienkach fermentácie unikátna a preto aj látky produkované kvasinkami sa vo víne nachádzajú v rôznych koncentráciách.

Odlišnosti boli zaznamenané nielen v porovnaní vývoja produkcie vybraných prchavých organických zlúčenín, ale aj porovnaním produkciev definovanom médiu oproti hroznovému muštu. V definovanom médiu absentuje hroznový substrát a teda množstvo prekurzorov pre tvorbu a interakciu s ďalšími zlúčeninami. Aj vzhľadom na to boli dosiahnuté relatívne koncentrácie pri fermentácii muštu vyššie ako pri fermentácii definovaného média a takisto trendy vývoja jednotlivých zlúčenín boli odlišné. Pri porovnaní použitých kmeňov (TC-NDK-DP2 a Oenoferm bellarome) si zlúčeniny zachovávali podobné trendy vývoja v rámci fermentácie toho istého média. Kmeň Oenoferm belle arome dosahoval vyššie relatívne koncentrácie pri fermentácii definovaného média a naopak kultúra TC-NDK-DP2 dosahovala vyššie relatívne koncentrácie pri fermentácii hroznového muštu.

Poďakovanie
Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe zmluvy APVV-15-0333. Ďakujeme tiež vinárstvu VÍNO NATURAL Domin & Kušický, s.r.o. za spoluprácu pri experimentoch.

Tereza Drtilová, Ivan Špánik, Pavel Timár, Katarína Furdíková, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU Bratislava

LITERATÚRA
[1] Muñoz-González, C., Rodríguez-Bencomo, J. J., Moreno-Arribas, M. V., Pozo-Bay-ón,M. Á.: Beyond the characterization of wine aroma compounds: Looking for analytical approaches in trying to understand aroma perception during wine consumption, Anal. Bioanal. Chem., 401 (5), 1501–1516, 2011
[2] Furdíková, K., Ďurčanská, K., Špánik,. I., Malík, F.: Inf uence of yeast strain on aromatic prof le of Gewürztraminer wine, LWT – Food Sci. Technol., 59 (1), 256–262, 2014
[3] Furdíková, K., Malík, F.: Vplyv kvasiniek na aromatický prof l vína, Vinič a víno,7, 61–63, 2007
[4] Furdíková, K., Bajnociová, L., Drtilová, T., Malík, F., Špánik, I.: Estery- súčasť primárnej a sekundárnej arómy hroznového vína, Vinič a víno, 6, 198-príloha 3, 2016
[5] Furdíková, K., Bajnociová, L., Makyšová, K., Malík, F., Špánik, I.: Vyššie alkoholy ako súčasť primárnej a sekundárnej arómy hroznového vína, Vinič a víno, 4, 198, 123- 126, 2016
[6] Furdíková, K., Bajnociová, L., Malík, F., Špánik, I., 2017.: Investigation of volatile profile of varietal Gewürztraminer wines using two-dimensional gas chromatography. Journal of Food and Nutrition Research 56 (1), 73–85
[7] Hazelwood, L. A., Daran, J., van Maris, A. J. A., Pronk, J. T., Dickinson, J. R.: The Ehrlich Pathaway for Fusel Alcohol Production: a Century of Research on Saccharomyces cerevisiae Metabolism, Applied and Environmental Microbiology, 2259-2266, 2008
[8] Furdíková, K., Ďurčanská, K., Špánik,. I., Malík, F.: Inf uence of yeast strain on aromatic prof le of Gewürztraminer wine, LWT – Food Sci. Technol., 59 (1), 256–262, 2014
[9] Jackson R.S. (2008): Wine Science: Principles and Applications. 3rd Edition. Elsevier. ISBN 9780080568744, 2008
[10] Furdíková, K., Makyšová, K., Špánik, I.: Ef ect of Indigenous S. cerevisiae Strains on Higher Alcohols, Volatile Acids, and Esters in Wine, Czech J. Food Sci., 35 (2), 138- 139, 2007
[11] Darsonval, M., Alexandre, H., Grandvalet, C.: Genetically engineered Oenococcus oeni strains to highlight the impact of estA2 and estA7 esterase genes on wine ester prof le, Food Microbiol., 60, 21–28, 2016

Tags: 05/2017