Abstrakt
Cieľom tejto práce bolo uplatnenie nekultivačných metód na získanie poznatkov o mikrobiálnych spoločenstvách prítomnýchna hroznových bobuliach, v mušte a v ľadovom víne. Použili sa metódy polymerázovej reťazovej reakcie, klonovania a sekvenovania.Výsledky detekcie húb a baktérií sa porovnali so štandardnou kultivačnou analýzou. Prístup s aplikáciou molekulárno-biologických techník umožňuje získanie komplexnejšieho obrazu o diverzite mikrof óry a tiež detekciu nekultivovateľných mikroorganizmov. Charakteristická mikrof óra procesu produkcie ľadového vína nebola doteraz dôkladne preštudovaná.

Abstract
In this study culture-independent approach was applied in order to have a better view of the microbial communities present on grape, must and almost ice wine. The molecular-biology methods of polymerase chain reaction, cloning and sequencing were used. Results of fungi and bacteria detection were compared with those of standard microbiology method. Application of molecular-biology techniques enables to gain complex view at microbial diversity and detection of non-culturable microorganisms. Characteristic microflora occurring during the production of ice wine was not properly investigated until now.

ÚVOD

Produkcia ľadového vína – druhu dezertného vína vyrobeného z hrozna, ktoré sa nechá počas mrazov na kre viniča – má svoju dávnu tradíciu pochádzajúcu ešte z rímskych čias. Jeho výroba je typická pre oblasti zemepisnej šírky s  prevažujúcou chladnou klímou, ako napríklad Kanada (najväčší producent ľadového vína) a niektoré oblasti strednej Európy (vrátane Slovenska). Podľa našich poznatkov však charakteristická mikroflóra procesu produkcie ľadového vína nebola doteraz dôkladne preštudovaná. Ako je známe, prítomnosť rôznych mikroorganizmov môže vplývať pozitívne na chuť a vôňu vína, avšak môže mať aj negatívny vplyv. Preto je monitorovanie mikrof óry v  procese výroby vína zaujímavé nie len z hľadiska získania teoretických poznatkov, ale aj z  pohľadu praktického využitia. Moderné metódy založené na princípe molekulárno-biologických prístupov umožňujú detekciu aj nekultivovateľných mikroorganizmov,ktorých prítomnosť nie je možné zistiť klasickými kultivačnými metódami.

MATERIÁL A METÓDY

Analyzovali sa vzorky hroznových bobúľ odrody Veltlínske zelené (poškodené i  nepoškodené bobule), zmrznuté bobule, vzorky muštu zo strednej fázy fermentácie a  ľadového vína. Na  izoláciu húb a  kvasiniek sa použili dve mikrobiologické médiá: kompletné médium YPD (kvasničný extrakt, dextróza, peptón, agar) a agar so zemiakovou dextrózou (PDA). Na izoláciu bakteriálnych kmeňov boli použité médiá R2A, GYC, MRS a MRS s paradajkovou šťavou. Izoláty sa klastrovali s použitím ITS-PCR na detekciu húb a  kvasiniek (primery: ITS3 (GCATCGATGAAGAACGCAGC); ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC; Kraková a  kol., 2012) a  ITS-PCR na  baktérie (primery G17 (GTGAAGTCGTAACAAGG) a  zmes GplusR (CGTCCTTCATCGGCT) a  GminusR (CGTCCTTCATCGCCT); Godálová a  kol., 2016). Amplikóny sa separovali kapilárnou elektroforézou na prístroji Qiaxcel. Reprezentatívne kmene z každého klastra sa identifikovali sekvenovaním ITS-PCR orientovanou na  huby a  kvasinky (ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG); ITS4) alebo s  využitím primerov pre bakteriálnu 16S rDNA (27f (AGAGTTTGATCMTGGCTCAG); 685r (TCTACGCATTTCACCGCTAC). DNA a  RNA sa extrahovali z vyššie spomenutých vzoriek (nepoškodené bobule (označené G), poškodené bobule (D), zmrznuté bobule (W), mušt zo strednej fázy fermentácie (M1) a  mušt zo záverečnej fázy fermentácie (M2)). Vzorky sa analyzovali metódou DGGE s  konštrukciou knižníc klonov orientovanou na  28S (huby a  kvasinky; Sádecká a  kol., 2016) bakteriálnu 16S rRNA (Kraková a kol., 2015, Kraková a kol., 2016).

VÝSLEDKY

V  dynamickom procese rôznych stupňov výroby vína bola konštantne detekovaná prítomnosť Hanseniaspora uvarum s  výnimkou posledného štádia – muštu zo záverečnej fázy fermentácie (M2). Kvasinky druhu Saccharomyces cerevisiae boli identifikované na poškodených bobuliach a  potom vo všetkých ostatných fázach vinifikácie. Významná prítomnosť rôznych kmeňov sa zistila u  druhov Pichia a  Metschnikowia, a to na poškodených i zmrznutých bobuliach hrozna. Prítomnosť Starmerella bacillaris/ Candida zemplinina sa zistila len v poškodených bobuliach.

Štyri agarové médiá, použité na  kultiváciu baktérií, umožnili izoláciu rôznych bakteriálnych kmeňov a  druhov. Na  poškodených a  nepoškodených bobuliach sa zistila prítomnosť mikroorganizmov druhov Pantoea, Enterobacter a  Gluconobacter. Baktérie mliečneho kvasenia (Lactobacillus, Leuconostoc a  Lactococcus) spolu so zástupcom druhu Staphylococcus sa objavili na poškodených bobuliach zo septembra 2014. V ďalších fázach vinifikačného procesu sa zvyšovali koncentrácie baktérií Staphylococcus, Leuconostoc a  Lactococcus.

Odlišná situácia bola v  prípade DGGE-klonovania (analýza DNA a RNA), pretože sa zistila len slabá podobnosť detekovaných druhov v porovnaní s  kultivačnými metódami. Baktérie mliečneho kvasenia boli takmer výlučne reprezentované druhom Lactococcus lactis. V niektorých fázach boli dominantne zastúpené baktérie rodovPseudomonas, Ewingella, Rivibacter a  Arthrobacter. Boli identifikované aj rôzne druhy húb: Aureobasidium pullulans, Penicillium crustosum, Cladosporium spp., Cryptococcus victoriae a  Botrytiscinerea (obrázok 1; obrázok 2).

Kombinácia kultivačných a  nekultivačných metód (analýza DNA a  RNA) umožnila sledovanie diverzity mikroflóry počas dynamického procesu výroby vína. Súčasne sa dosiahol komplexnejší obraz o prítomnosti mikroorganizmov v jednotlivých štádiách výroby vína. Niektoré výsledky poukazujú na  to, že prítomnosť určitých mikroorganizmov bolo možné zistiť len porovnaním obidvoch prístupov (kultivačného a  nekultivačného). Analýza RNA zase poskytla novýobraz o diverzite mikroflóry.

Poďakovanie
Táto práca bola vytvorená realizáciou projektu „Využitie vedeckých poznatkov pre kvalitné a zdravé potraviny“, kód ITMS projektu 26240220090, na základe podpory operačného programu Výskum a vývoj financovaného z Európskeho fondu regionálneho rozvoja a bola podporovaná Agentúrou na podporu výskumu a vývoja projektom APVV-0344-12.

LITERATÚRA

Godálová, Z., Kraková, L., Puškárová, A., Bučková, M., Kuchta, T., Piknová, Ľ. and Pangallo, D., 2016. Bacterial consortia at dif erent wine fermentation phases of two typical Central European grape varieties: Blaufränkisch (Frankovka modrá) and Grüner Veltliner (Veltlínske zelené).International journal of food microbiology,  217, pp.110-116.

Kraková, L., Chovanová, K., Ženišová, K., Turcovská, V., Brežná, B., Kuchta, T. and Pangallo, D., 2012. Yeast diversity investigation of wine-related samples from two different Slovakian wine-producing areas through a multistep procedure.  LWT-Food Science and Technology,  46(2), pp.406-411.

Krakova, L., De Leo, F., Bruno, L., Pangallo, D. and Urzì, C., 2015. Complex bacterial diversity in the white biof lms of the Catacombs of St. Callixtus in Rome evidenced by different investigation strategies.  Environmental microbiology,  17(5), pp.1738-1752.

Kraková, L., Šoltys, K., Budiš, J., Grivalský, T., Ďuriš, F., Pangallo, D. and Szemes, T., 2016. Investigation of bacterial and archaeal communities: novel protocols using modern sequencing by Illumina MiSeq and traditional DGGE-cloning.  Extremophiles, pp.1- 14

Sádecká, J., Šaková, N., Pangallo, D., Koreňová, J., Kolek, E., Puškárová, A., Bučková, M., Valík, L. and Kuchta, T., 2016. Microbial diversity and volatile odour-active compounds of barrelled ewes‘ cheese as an intermediate product that determines the quality of winter bryndza cheese.LWT-Food Science and Technology,  70, pp.237-244.

 

Ľubica Piknová 1 , Domenico Pangallo2, Katarína Ženišová 1, Mária Bučková 2, Andrea Puškárová 2,1 Národné poľnohospodárske a potravinárske centrum – Výskumný ústav potravinársky, Bratislava, 2 Ústav molekulárnej biológie SAV, Bratislava

Tags:

No Comments
vinohradnícky výskum